III. Expérimentations

 1) Milieu de culture :

     

        En ce qui concerne l'élaboration du milieu de culture, nous avons employé du liquide de Knop enrichi avec des phytohormones ainsi qu'un gélifiant, l'agar-agar, une algue marine.

 

Le milieu est donc composé de :

-Nitrate de calcium : 1g

-Nitrate de potassium : 0.25g

-Sulfate de magnésium : 0.25g

-Phosphate monopotassique : 0.25g

-Sulfate ferrique : 0.001g

-Eau distillée : 1L

 

Nous y avons ajouté :

-Phytohormones  (cf II. Culture in vitro - 3) Morphogenèse) : •Auxines : 1mg.L-1.

                                                                                                                            •Cytokinines : 1mg.L-1

-Gélifiant  (agar-agar).

 

 

2) Protocole :

       

Notre protocole est issu partiellement d'un ouvrage, Travaux pratiques de biologie de Dider Pol aux Editions Bordas et mis en place avec l'aide du chargé de laboratoire de SVT.

 

Voici la liste du matériel utilisé pour nos manipulations : 

-liquide de Knop enrichi en phytohormones et en gélifiant.

-flacons à goulots larges avec leurs bouchons.

-eau de Javel diluée à 3%.

-alcool à 70°.

-Hexanios (liquide aseptisant utilisé pour stériliser le matériel, notamment en chirurgie).

-eau distillée.

-bec électrique (en remplacement d'un bec à gaz).

-béchers.

-verres de montre.

-coton cardé.

-papier absorbant.

-ciseaux fins.

-pinces longues.

-scalpel.

-gants et masque.

Il est essentiel que le matériel soit le plus stérile possible !

 

          Hexaniol                Bec électrique                   Paillasse 1

 

              Instruments plongés dans l'Hexanios                                              Bec électrique                                               Espace de travail sous la hotte

 

 

Le protocole appliqué est le suivant :

-Laver soigneusement les flacons destinés à la culture et les rincer à l'eau distillée puis les essuyer avant de les stériliser.

-Faire chauffer le milieu et le porter à ébullition jusqu'à dissolution de l'agar-agar.

-Verser ce milieu dans les flacons, sans en mettre sur les bords, sur une épaisseur de 2 à 3 cm.

-Boucher les flacons avec un tampon de coton cardé.

-Stériliser les instruments ainsi que les verres de montres. Les instruments métalliques sont placés dans une solution d'Hexanios et en sont retirés au moment de leur utilisation.

-Nettoyer soigneusement la paillasse où se trouve le bec électrique à l'eau de Javel.

-Disposer un bécher rempli d'alcool à 90° dans la zone stérile et y placer les paquets contenant le matériel.

-Prélever une feuille jeune sur le végétal hors de la zone stérile.

-La placer dans un bécher contenant de l'alcool à 70° pendant 20s puis dans un bécher contenant de l'eau de Javel pendant 5min.

-Rincer trois fois avec de l'eau stérile.

-Placer la feuille sur du papier absorbant dans la zone stérile.

-Découper un explant de 2 cm de long sur 1 cm de large environ.

-Déboucher les flacons en le maintenant au dessus du bec électrique.

-Saisir un explant et l'enfoncer au centre du flacon jusqu'à sa moitié en évitant de toucher le verre et le milieu avec la pince.

-Placer un tampon de coton sur le goulot.

-Noter la date et le numéro sur le flacon.

-Celui-ci est prêt, il faut maintenant le disposer devant une fenêtre éclairée (mais pas par la lumière directe du Soleil).

 

Photo

 Ensemble des flacons de la première expérience

 

3) Déroulement :

 

 

 

Vidéo de la première expérience de culture in vitro

 

 

 

 

N° Flacon Nombre d'explants Résultats +7j Résultats +14j Résultats +21j Résultats +28j
1 1 Nécroses importantes en
divers points de l'explant
Nécroses importantes en divers points de l'explant
contaminations par des  agents pathogènes
  
2 1 Nécroses importantes à la base et
légère sur la partie supérieure
Nécroses légères à la base et
sur la partie supérieure (peu d'évolution)
Nécroses importantes à la base et
sur la partie supérieure 
Retrait de l'explant
3 2 Apparition de moisissures -
nécrose légère dans la zone supérieure
Nécroses importantes en divers points des explants -
dégénérescence d’un explant et apparition d’agents pathogènes
    
4 1 Dégénérescence et
retrait de l'explant 
   
5 avec ajout
d'auxines
2 1 explant retiré -> apparition moisissures
1 explant atteint d’une nécrose très légère
Développement des nécroses -
apparition d’agents pathogènes

  Tableau des résultats de la première expérience de culture in vitro

          

 

 

 

         Flacon 0j                          Flacon 7j                      Flacon 14j

                       Flacon  n°1  +0j                                                         Flacon n°1  +7j                                                             Flacon n°1  +14j

 

Il faut noter que les moisissures et autres agents pathogènes se sont développés à partir des explants et non sur la gélose elle-même (qui est exempt de sucre), ce qui nous laisse supposer une mauvaise désinfection du végétal malgré le suivi du protocole.

         Nous avons réessayé une culture in vitro en utilisant de l'huile essentielle de lavande (qui serait un agent aseptisant) diluée à 10% dans de l'huile végétale de tournesol pour remplacer l'eau de Javel (que nous supposions responsable des nécroses sur la partie aérienne puis inférieure des explants).  Nous avons appliqué le même protocole à l'exception des étapes concernant l'eau de Javel puisque nous avons juste placé puis retiré rapidement du mélange d'huiles.

Après 7 jours, la partie supérieure était nécrosée tandis que la base était saine. On n'a observé aucun développement d'agents pathogènes sur la gélose, signe que l'huile essentielle a fait effet et/ou que les conditions d'asepsie ont été respectées.

Après 14 jours, il ne semble pas y avoir d'évolution majeure.

Après 21 jours, les explants semblent avoir dégénéré mais une évolution pourrait encore être possible.

Après 28 jours, les explants ont clairement dégénéré.

Nous pouvons donc en conclure que l'huile essentielle de lavande permet, de manière efficace, l'absence de développement de champignons à la surface de la gélose, mais nous devons pursuivre dans notre recherche sur les causes de cet "échec".

 

4) Acclimatation :

   

       L'acclimatation est une phase très complexe et difficile à mettre en œuvre, que nous n'avons pas eu la chance d'atteindre. La complexité réside dans le fait que le végétal passe de conditions de culture favorables et idéales, à un milieu plus inhospitalier où prospèrent des agents pathogènes et autres concurrents potentiels. Ils viennent s'ajouter à des facteurs environnementaux plus rudes.

Le substrat dans lequel est placé le végétal en sortie de laboratoire doit être désinfecté (par exemple à la vapeur), en créant un vide biologique. Celui-ci est censé entraîner un remplacement des être vivants néfastes par des organismes utiles.

 

                

                                                                                    Végétaux multipliés par culture in vitro en phase d'acclimatation

 

 

5) Les probables causes de l'échec :

 

         Après avoir observé la dégénérescence des explants, nous avons cherché les causes de cet "échec".

-Nous avons pensé, dans un premier temps que l'eau de Javel, de par son côté corrosif pouvait avoir attaqué les tissus et provoqué leur nécrose. Nous avons pour cela tenté une seconde expérience en remplaçant ce produit par de l'huile essentielle de lavande diluée mais avons tout de même observé une dégénérescence de la partie aérienne de l'explant. Nous aurions pu aussi tenter de retirer les zones nécrosées mais cela semblait assez compliqué à mettre en œuvre notamment en prenant compte de l'asepsie, du maintien de l'hygrométrie, ...

-Nous nous sommes questionnés sur le fait que nous ne maîtrisions pas toutes les conditions nécessaires à une culture in vitro comportant des résultats opimaux (luminosité, température, hygrométrie) et qui pouvaient avoir compromis nos expériences.

-L'asepsie peut aussi être remise en question, essentiellement celle des explants que nous avons prélevés car nous avons remarqué que les moisissures apparaissaient au niveau du fragment végétal et non sur la gélose. L'huile essentielle semble avoir résolu ce problème, n'observant pas au quatorzième jour de traces d'agents pathogènes.

-Enfin, certaines plantes et notamment des orchidées nécessitent une symbiose pour se développer en interaction avec leur biotope et les autres êtres vivants qui en font partie. Cette raison pourrait être une des causes à retenir malgré le fait que nos premières recherches nous avaient permis d'affirmer qu'il était possible de réaliser une culture in vitro sur des orchidées sauvages en mettant les explants dans un milieu comportant les nutriments nécessaires à la survie et à la croissance de l'explant.

Pour réaliser une culture in vitro d'une espèce étant en symbiose avec un autre organisme il y a deux solutions :

Premièrement, on peut séparer l'organisme (un champignon par exemple) et l'orchidée puis les cultiver séparément et enfin les remettre ensemble lors de la réintroduction en milieu naturel. Il faut cependant arriver à multiplier les deux êtres vivants de manière séparée. L'autre technique consiste à cultiver tous les organismes ensemble, dans le même milieu de culture. Cependant il est plus difficile de maintenir des conditions d'asepsie idéales car il faut éliminer les agents pathogènes tout en conservant les êtres vivants de la symbiose .

Cependant, ne connaissant l'espèce mis en culture, nous ne pouvons pas savoir si elle recquiert la mise en place d'une symbiose pour l'assimilation correcte des nutriments dont elle a besoin.

-De plus l'espèce employée pour cette culture in vitro semble assez fragile : on peut y voir une cause de "l'échec" mais nous avons quand même réussi à maintenir des cellules d'orchidée pendant 21 jours, ce qui serait très difficile voire impossible dans le milieu naturel.           

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