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II. Culture in vitro

 

           La culture in vitro est une technique de multiplication reposant sur la capacité des cellules de se diviser en masse, en combinant gain de temps et d'espace dans un milieu artificiel. Ainsi, nous évoquerons ici la culture de méristèmes  de même que la micropropagation (ou microbouturage), en détaillant précisément cette technique.

 

 

                                                                     

 

                                                                         Différents végétaux en culture in vitro

 

 

1) Avantages / inconvénients et choix des techniques :

 

Avantages de la culture in vitro :

 

-une production rapide et en masse :  En prélevant quelques cellules, on peut régénérer de manière rapide une plante entière et complète, en réduisant de manière très importante les cycles de développement et donc la durée de croissance.

-une production en toute saison :  En laboratoire, il est possible de recréer artificiellement de nombreuses conditions naturelles nécessaires à la croissance des végétaux que l’on désire multiplier. Ceci est plus difficile voire impossible in vivo, avec des méthodes traditionnelles (perte très importante  d’énergie pour l’éclairage et le chauffage).

 

Photographie de flacons contenant des végétaux en multiplication in vitro de masse

 

-le raccourcissement des cycles de développement :  De plus, les conditions idéales que l’on peut obtenir en laboratoire permettent une croissance optimale des végétaux, ce qui entraîne évidemment un raccourcissement des cycles de développement puisque la plante dispose de tout ce dont elle a besoin.

-l’obtention de clones sélectionnés :  Les différentes techniques de culture in vitro rendent possible la multiplication de clones sélectionnés, sans qu'ils soient modifiés par la reproduction sexuée.

-la production de substances biochimiques :  Les différentes techniques de culture in vitro permettent de produire des cellules dont on va extraire des substances biochimiques (mais ce n'est pas notre sujet).

-la facilité de stockage, de conservation et de transport :  La culture in vitro permet de stocker plus facilement des végétaux car ceux-ci prennent moins de place. En effet, un récipient (type erlenmeyer) peut contenir plusieurs cals ou très jeunes plants récemment formés, conservés par réfrigération (et non par congélation car cela risquerait d'entraîner un éclatement des cellules). Le stockage est facilité (moins d’espace nécessaire comparé à la reproduction sexuée ou bouturage) ainsi que le transport (il y a moins besoin d’espace ce qui entraîne une diminution de rejets de gaz toxiques pour une même quantité de plants) et la conservation (arrêt de la croissance et maintien à un stade de développement). Cela peut donc aussi faciliter l’échange entre différentes institutions. En plaçant les végétaux au froid, ils se conservent très bien, sont à l’abri des contaminations et ne prennent que peu de place. Suite à un déplacement, ils sont en meilleur état grâce à la réfrigération.

 

Photographie de végétaux en culture in vitro : peu d'espace est nécessaire

 

-l’assainissement des végétaux :  Le méristème est une zone de croissance de moins d’un millimètre et exempt de tout virus. Il subit des multiplications cellulaires en permanence (mitoses). En utilisant la culture de méristèmes, on arrive à multiplier des cellules saines, ce qui aboutit à l’obtention d’individus sains. Toutefois, ils ne possèdent pas de facultés particulières de résistance aux attaques virales. Cela permet donc d’assurer la survie d’une espèce en proie à des agressions virales.

-la diminution des dépenses énergétiques :  La diminution des dépenses énergétiques est permise grâce à un espace de multiplication, de croissance et de stockage plus faible. Le chauffage et l’éclairage, notamment, sont moins coûteux car moins utilisés du fait de la réduction du volume et de la surface  où ils sont nécessaires. La culture in vitro permet aussi de réduire les coûts de transport (comme vu  précédemment).

On pourrait donc penser que la multiplication in vitro est moins onéreuse grâce aux qualités citées ci-dessus, mais ce n’est en réalité pas le cas.

 

Inconvénients :

 

-la nécessité d’un personnel qualifié :  Il est nécessaire d’employer un personnel qualifié qu’il faudra, en conséquence, rémunérer de manière plus importante. Ceci entraîne donc une augmentation des coûts de production.

-la perte de caractères intéressants :  Au bout d’un certain nombre de multiplications, on peut observer une perte de gènes intéressants (mutations), d’où la nécessité de revenir parfois à la reproduction sexuée. De plus, il n’y a pas de brassage génétique, c'est à dire des variations génétiques au niveau d'une population, ce qui est contraire à ce que l'on rencontre à l'état naturel.

-l’asepsie des explants : Il est nécessaire que les fragments végétaux soient dépourvus de tout organismes vivants afin de ne pas contaminer les cultures dans un milieu où leur croissance serait optimale. Cette propagation serait gênante puisqu'elle risquerait de compromettre la multiplication des végétaux sélectionnés.

 

Moisissure

Photographie de moisissures se développant dans un flacon de culture in vitro autour d'un explant

 

-l’acclimatation :  Il s’agit d’une phase délicate où les végétaux passent d’un milieu idéal  à un environnement plus agressif. Ils subissent la concurrence directe d'organismes vivants extérieurs et néfastes. Il est nécessaire de diminuer l’hygrométrie très progressivement et passer à des conditions de culture proches du milieu naturel.

-la symbiose :  De nombreuses recherches montrent que certaines espèces végétales établissent une symbiose avec des espèces animales (ou éventuellement des espèces de champignons). Nous pouvons donc penser que la culture in vitro pourrait échouer pour certains individus nécessitant une symbiose, si les conditions de laboratoire, censées être idéales, ne parviennent pas à la remplacer.

-la vitrification :  Des déséquilibres hormonaux peuvent entraîner l'apparition de malformations, ce qui conduit à des individus ne respectant plus les caractéristiques de l'espèce.

 

Vitrification

           La vitrification : des déséquilibres hormonaux sur différentes espèces

 

          Nous avons donc décidé de pratiquer des expérimentations de micro-propagation, et ce, pour diverses raisons, notamment en raison des contraintes techniques. En effet, il nous était difficile de se procurer des méristèmes durant l'hiver et le micro-bouturage nous apparait comme la technique la plus aisée à mettre en œuvre, avec les moyens disponibles au laboratoire de biologie de notre lycée.

 

 

2) La totipotence cellulaire :

 

      Une cellule est dite totipotente lorsqu'elle possède la capacité de se dédifférencier et se différencier en n'importe quelle cellule spécialisée. Dans notre cas, cette capacité d'obtenir des fonctions diverses permet, à partir de quelques cellules, de recréer un individu complet, fonctionnel, structuré, pluricellulaire et identique à la plante mère, et ce, quel que soit l'organe d'origine. La totipotence cellulaire est propre à tous les végétaux et induit théoriquement une "immortalité" de ceux-ci.  

 

 Cal : amas de cellules végétales indifférenciées

 

         Le cal végétal est l'illustration même de la totipotence cellulaire et la démonstration de son existence. En effet, grâce à celui-ci, il est possible de recréer des individus identiques à la plante mère.

 

 

3) La morphogenèse :

 

      La morphogenèse correspond, comme son étymologie l'indique, au développement des formes d'un individu. Chez une plante, nos recherches et nos connaissances personnelles nous apprennent que la zone de croissance en longueur d'un végétal se situe au niveau de l'apex. Ainsi, les cellules indifférenciées de l'apex ont deux devenirs possibles :         

-elles peuvent continuer des cycles successifs de mitose.                                                                                                                                                                                                                                             

-se différencier grâce aux mécanismes de totipotence cellulaire développés ci-dessus, et ainsi se spécialiser.

 

      La "mise en forme" d'un végétal est conditionnée par le biais des phytohormones :

-Les auxines sont des hormones qui stimulent la division cellulaire et permettent la formation de cals, des amas cellulaires à partir desquels se développent les futurs individus. Elles disposent d'un fort pouvoir rhizogène, c'est à dire le développement de la partie inférieure d'un végétal, le système racinaire. Ces phytohormones permettant la dominance apicale (la dormance des bourgeons inférieurs au profit de la croissance du bourgeon supérieur) et sont  produites dans la partie supérieure de l'organisme.                        

L'auxine la plus répandue est l'acide indole-3-acétique, mais il existe d'autres molécules naturelles.

-Les cytokinines permettent la régulation des fonctions immunitaires des végétaux, mais en ce qui nous concerne, elles jouent un rôle primordial dans la différenciation et le débourrement des bourgeons ainsi que la mérèse.

On peut "orienter" la culture en faisant varier le rapport de la quantité d'auxines par la quantité de cytokinines.                                                                                                                                     

•Si celui-ci est égal à 1, on observera uniquement la formation de cals.                                                                                                                                                                                                                       

•S'il est inférieur à 1 (quantité de cytokinines plus importante), alors il y aura développement de feuilles et de fleurs sur le cal.                                                                                                            

•S'il est supérieur à 1 (quantité d'auxine plus importante), des racines se développeront sur le cal.

 

Il est donc nécessaire de faire varier ce rapport suivant ce que l'on désire obtenir. Toutefois, les conséquences de l'utilisation des phytohormones sont extrêmement complexes et variées, ce qui les rend difficiles à appréhender et à maîtriser.

 

Schéma des différents impacts et lieux de productions d'auxine et cytokinies

 

Schéma relatif aux phytohormones présentes dans un organisme végétal

 

Basipète : qui va vers la base.

Acropète : qui va vers l'apex.

Bourgeon axillaire : bourgeon situé à l'aisselle des rameaux végétaux.

 

-Nous pouvons aussi noter la présence d'acide abscissique, d'éthylène et de gibbérellines, leur importance et leur rôle étant mineurs comparés au couple auxines-cytokinines présent dans notre milieu de culture (nous y reviendrons ultérieurement).

 

4) La multiplication : une reproduction conforme de la cellule :

 

       La multiplication des cellules végétales repose sur le principe de la division cellulaire, la mitose.

Ce processus se découpe en quatre phases, durant lesquelles l'organisation chromosomique est bouleversée :

-la prophase : l'enveloppe nucléaire se désorganise, les chromosomes sont doubles et constitués de deux chromatides juxtaposées (qualifiées de "sœurs"). Celles-ci ne sont pas visibles en microscopie optique et l'ensemble des chromosomes se présente sous la forme de chromatine.

-la métaphase : les chromosomes s'alignent au centre de la cellule, au niveau de son équateur. Une organisation symétrique et éphémère apparaît, de même que des câbles protéiques qui relient l'extrêmité des chromatides aux deux pôles de la cellule.

-l'anaphase : les chromatides sœurs sont séparées par les câbles protéiques qui les entraînent aux extrêmité de la cellule. Le nombre de chromosomes est donc divisé par deux, une moitié destinée à chaque pôle cellulaire. Ceux-ci se répartissent donc de manière symétrique, en demi-cercle à chaque extrêmité de la cellule.

-la télophase : les chromosomes se réorganisent en "pelotes" tandis que la paroi cellulaire se divise à l'équateur de la cellule pour former deux cellules filles individuelles.

 

Mitose

 

La mitose permet ainsi de créer de nouvelles cellules puisqu'une cellule mère possède, durant la prophase, des paires de chromosomes homologues à deux chromatides. Durant le partage, chaque cellule fille reçoit donc une chromatide de chaque paire de chromosomes de la cellule mère. Ce processus permet l'apparition de deux nouvelles cellules avec la conservation du nombre de chromosomes induisant un partage équilibré, égal, du patrimoine génétique.

 

 

 

 

            Le cycle cellulaire est la succession d'une mitose (prophase, métaphase, anaphase, télophase) et d'une interphase (une phase de réplication de l'ADN comprise entre deux phases de croissance cellulaire). Nous pouvons dire que l'organisation et l'état des chromosomes varient durant le cycle cellulaire.

Ainsi, durant la première phase de croissance, les chromosomes sont simples et décondensés, en se présentant sous la forme d'une "pelote" d'ADN. 

Ensuite, durant la phase de réplication, les chromosomes passent d'une paire de chromosomes simples à une paire de chromosomes doubles, avec la duplication de chaque gène sur chaque chromatide sœurs de la paire.

Une phase de croissance démarre pour aboutir sur une mitose qui va conduire à la division de la cellule mère.

 

 

Quantité d'ADN et état des chromosomes au cours du cycle cellulaire

 

         

Durant la réplication du matériel génétique, les deux brins d'acide désoxyribo-nucléique sont séparés. Chaque brin sert de modèle pour la synthèse d'un nouveau brin respectant la complémentarité des bases, c'est à dire qu'aux bases azotées et aux sucres présents s'ajoutent des nucléotides complémentaires entre eux : l'adénine s'associe à la thymine et la cytosine à la guanine. Une molécule initiale est ainsi recopiée en deux molécules, censées être identiques à la précédente. En effet, la réplication de la molécule d'ADN est semi-conservative car durant celle-ci, les deux brins anciens sont conservés et deux nouveaux sont synthétisés.

 

 

Replication